多糖單糖組成檢測方法

單糖組成分析是研究多糖結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及構(gòu)效關(guān)系的基礎(chǔ)。其研究中主要包括多糖水解的方法和條件、衍生化方法和單糖檢測方法，如圖1所示。常用的水解方法主要有酸水解法和酶解法，此外還有氧化降解法、超聲降解法、輻射降解法等。由于單糖不具有紫外與熒光吸收，檢測時常將其進行衍生化處理。單糖組成常用的檢測方法一般有4種，分別是氣相色譜法 (GC)、高效液相色譜法 (HPLC)、離子色譜法 (IC) 和薄層色譜法 (TLC)。

GC法較早用于分析多糖單糖組成，方法靈敏度高，各單糖的色譜峰的分離度良好。由于單糖不具有揮發(fā)性，采用GC法測定時，常對單糖進行硅烷化或乙酸酯化處理，使其成為易揮發(fā)且對熱穩(wěn)定的衍生物。GC法只適合測定中性多糖，不適宜測定糖醛酸及N-乙酰氨基糖的檢測。GC法測定多糖的單糖組成，常用的檢測器包括氫火焰檢測器(FID)、質(zhì)譜檢測器 (MS)。

HPLC法

HPLC法是測定多糖單糖組成的常用方法之一，較GC法更適用于單糖組成較為復雜的多糖檢測。HPLC法常使用鍵合相硅膠柱（如C18柱）和氨基柱。目前基于離子交換、空間排阻、配位交換、分配吸附等多種分離原理的新型糖分析柱也日益應(yīng)用廣泛，如SugarS系列、SugarKS系列、AsahipakGS-220HQ、AsahipakNH2P系列色譜柱等。HPLC法檢測單糖時，常用檢測器主要有紫外檢測器(VWD)、熒光檢測器 (FLD)、示差折光檢測器(RID)、蒸發(fā)光散色檢測器(ELSD)、電噴霧檢測器(CAD)、電化學檢測器 (ECD)、二極管陣列檢測器(DAD)，各檢測器特征比較如表1所示。根據(jù)所用檢測器的不同，可分為衍生化后測定和直接測定2種情況。一是聯(lián)用DAD、VWD或FLD時，水解后的單糖需衍生化處理才能被測定，實驗室常用的衍生試劑如1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）。此法可檢測酸性、中性和堿性多糖的單糖組成[4]，但用于酮糖測定的衍生化法很少；二是聯(lián)用RID、ELSD、ECD、CAD時，可無需對單糖進行衍生化。

表：HPLC法聯(lián)用的各檢測器特征比較

IC法

IC法是一種新型液相色譜技術(shù)，基于離子型化合物中的離子成分，可與離子柱表面的帶電荷基團發(fā)生可逆性交換的原理，實現(xiàn)各化合物的分離。多糖水解后可直接通過IC法測定其單糖組成。

TLC法

使用TLC法測定單糖組成時，多糖水解后無需衍生化。TLC法常用薄層板為硅膠G板和微晶纖維素板、活性炭層析柱，常用展開劑和顯色劑見圖1。TLC法有操作方便、分離快速、設(shè)備簡單等優(yōu)點，但其對單糖的分離度低，實驗條件如溫度、濕度、操作者的實驗水平等，對實驗結(jié)果的影響較大，在靈敏度和準確度上低于HPLC法，常用作定性分析。